6月9日，國家蛋白質(zhì)科學研究（上海）設(shè)施五線六站用戶北京生命科學研究所邵峰研究員及其合作者生物物理研究所王大成組在《自然》（Nature）雜志在線發(fā)表題為“Pore-forming activity and structural autoinhibition of the gasdermin family”的長文（article），揭示了GSDMD蛋白以及其它gasdermin家族蛋白介導(dǎo)細胞焦亡和在天然免疫中發(fā)揮功能的分子機理。 

細胞焦亡或炎性壞死是一種程序性細胞壞死，表現(xiàn)為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物的釋放進而激活強烈的炎癥反應(yīng)。細胞焦亡是機體重要天然免疫反應(yīng)，在拮抗感染和內(nèi)源危險信號中發(fā)揮重要作用。過度的細胞焦亡會誘發(fā)包括敗血癥在內(nèi)的多種炎癥和免疫性疾病。傳統(tǒng)研究認為，細胞焦亡由包括caspase-1和caspase-4/5/11在內(nèi)的炎性caspase活化而誘發(fā)。Caspase-1在病原信號誘導(dǎo)形成的炎癥小體復(fù)合物作用下被激活；實驗室此前的工作表明caspase-4/5/11是細菌脂多糖（LPS，又稱內(nèi)毒素）的胞內(nèi)受體，在結(jié)合LPS后發(fā)生寡聚而活化，是革蘭氏陰性菌誘導(dǎo)敗血癥的關(guān)鍵因素（Shi et al., Nature 2014）。然而，20多年來人們對于炎性caspase如何誘導(dǎo)細胞焦亡的機理一直完全不清楚。在去年的一項突破性進展中，實驗人員找到了一個所有炎性caspase的共同底物蛋白GSDMD，炎性caspase通過切割GSDMD釋放其N端結(jié)構(gòu)域而引發(fā)細胞焦亡（Shi et al., Nature 2015）。GSDMD屬于一個被稱為gasdermin的功能未知的蛋白家族，該家族還包括GSDMA，GSDMB，GSDMC，DFNA5，DFNB59等。人的DFNA5和小鼠Gsdma3的遺傳突變分別導(dǎo)致非綜合征性耳聾和小鼠脫毛以及皮膚發(fā)炎等疾病，GSDMB基因的多態(tài)性和兒童哮喘的發(fā)生密切相關(guān)。該研究也發(fā)現(xiàn)GSDMA3蛋白雖然不是炎性caspase的底物，但其N端結(jié)構(gòu)域也能誘導(dǎo)細胞焦亡，并且，導(dǎo)致小鼠脫毛的突變體GSDMA3蛋白都喪失了分子內(nèi)自抑制作用進而顯示出持續(xù)誘導(dǎo)細胞焦亡的活性。然而，炎性caspase切割GSDMD如何引發(fā)細胞焦亡及其它gasdermin家族蛋白在細胞焦亡相關(guān)天然免疫中如何發(fā)揮功能的機制則仍然不清楚，這也是天然免疫研究的前沿熱點問題。 

在這項新的研究中，研究人員首先發(fā)現(xiàn)幾乎所有的gasdermin家族蛋白的N端結(jié)構(gòu)域都具有誘導(dǎo)細胞焦亡的功能，而除GSDMD外，其它家族成員并不是炎性caspase的底物，這個發(fā)現(xiàn)重新定義了細胞焦亡概念，開辟了一個新的程序性細胞壞死的研究領(lǐng)域。有意思的是，gasdermin家族的N端結(jié)構(gòu)域在細菌中也顯示出明顯的致死毒性。這一現(xiàn)象暗示gasdermin N端結(jié)構(gòu)域可能是通過直接破壞細胞膜而產(chǎn)生殺死細胞。為了驗證這一假設(shè)，他們制備了活化形式的GSDMD，GSDMA 和 GSDMA3蛋白，在體外脂質(zhì)體共沉淀的實驗中，這三種gasdermin蛋白的N端結(jié)構(gòu)域均能夠特異地結(jié)合磷酸化磷脂酰肌醇（phosphoinositide）或心磷脂（cardiolipin），而4, 5-二磷酸磷脂酰肌醇和心磷脂分別是真核細胞和原核細胞膜上特有的磷脂，這和gasdermin N端結(jié)構(gòu)域在真核細胞和細菌中均展示出細胞毒性完全吻合。通過生物化學和熒光顯微成像的細胞實驗，研究人員進一步證實，在真核細胞焦亡過程中，活化的gasdermin N端結(jié)構(gòu)域會從細胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細胞膜上，細胞隨后出現(xiàn)體積膨脹和細胞膜向胞外吐泡的現(xiàn)象。此外，活化的gasdermin N端結(jié)構(gòu)域重組蛋白只能從真核細胞內(nèi)部破壞細胞膜，而直接加入到細胞培養(yǎng)上清中的蛋白則不能裂解細胞，這也和磷酸化磷脂酰肌醇只分布在細胞膜內(nèi)側(cè)完全吻合。 

利用脂質(zhì)體泄漏實驗，研究團隊進一步發(fā)現(xiàn)gasdermin N端結(jié)構(gòu)域能夠高效特異地破壞含有4, 5-二磷酸磷脂酰肌醇或心磷脂的脂質(zhì)體，導(dǎo)致其發(fā)生嚴重泄漏，利用不同尺寸葡聚糖分子，他們發(fā)現(xiàn)破壞后的脂質(zhì)體只能允許小于10納米尺度的分子被釋放，該現(xiàn)象提示gasdermin N端結(jié)構(gòu)域有可能在脂膜上聚合形成規(guī)則的孔道。生化交聯(lián)實驗結(jié)果證實gasdermin N端結(jié)構(gòu)域在結(jié)合脂質(zhì)體或是在細胞焦亡中轉(zhuǎn)位上膜后都會發(fā)生高度聚合。利用負染電鏡的方法，他們首次觀察到gasdermin N端結(jié)構(gòu)域能在特異磷脂或天然磷脂組成的膜上打孔，形成很多蜂窩狀的孔道，這些孔道的內(nèi)徑約10-14 納米。進一步的電鏡分析揭示這些分子孔道具有16重對稱性，表明gasdermin N端結(jié)構(gòu)域在膜上形成16元聚合體的孔道。此外，他們還通過對GSDMA3蛋白高分辨率晶體結(jié)構(gòu)的解析，揭示了gasdermin N端結(jié)構(gòu)域作為一種全新的打孔蛋白的獨特結(jié)構(gòu)特征，以及與C端結(jié)構(gòu)域之間的精細的自抑制相互作用?；诮Y(jié)構(gòu)設(shè)計的點突變實驗結(jié)果進一步確認了gasdermin N端結(jié)構(gòu)域結(jié)合膜脂和在膜上打孔的特性是其誘導(dǎo)細胞焦亡的分子基礎(chǔ)。 

該研究證明了GSDMD是炎性caspase誘導(dǎo)細胞焦亡的直接執(zhí)行者，首次揭示了gasdermin 家族蛋白的N端結(jié)構(gòu)域具有在膜上打孔進而破壞細胞膜的功能，這不僅清晰闡明了炎性caspase通過GSDMD誘導(dǎo)細胞焦亡的分子基礎(chǔ)，也將細胞焦亡的概念重新定義為由gasdermin介導(dǎo)的細胞程序性壞死。研究結(jié)果不僅為針對GSDMD開發(fā)自身炎癥性疾病和敗血癥的藥物奠定了堅實的理論基礎(chǔ)，也為后續(xù)研究其它gasdermin蛋白在程序性細胞壞死和天然免疫中可能的生理功能開辟了道路。 

國家蛋白質(zhì)科學研究（上海）設(shè)施五線六站（BL18U1/BL19U1）為本課題結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)收集提供了支持，收到了高分率的硒帶衍射數(shù)據(jù)，直接順利解出了結(jié)構(gòu)。線站工作人員積極參與，為晶體結(jié)構(gòu)衍射數(shù)據(jù)收集提供了相應(yīng)的專業(yè)技術(shù)支持，為該成果的發(fā)表做出了有力貢獻。 

原文鏈接：http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature18590.html 

　　圖示：GSDMA3的晶體結(jié)構(gòu)以及Gasdermin家族蛋白分子內(nèi)自抑制的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)