2024年02月23日，《eLife》期刊在線發(fā)表題為《High-throughput mapping of single-neuron projection and molecular features by retrograde barcoded labeling》的研究論文。該研究由中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）陳躍軍研究組、上?？萍即髮W(xué)羅振革研究組以及臨港實(shí)驗(yàn)室李澄宇研究組合作完成。該研究通過融合高通量單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)和逆向病毒分子條碼標(biāo)記技術(shù)，建立了MERGE-seq技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腦內(nèi)單個(gè)神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄組和投射組的同時(shí)捕獲。研究以腹內(nèi)側(cè)前額葉皮層（vmPFC）為例，在單神經(jīng)元水平解析了vmPFC神經(jīng)元投射到下游不同腦區(qū)的投射模式和相應(yīng)的分子特征，為進(jìn)一步從單細(xì)胞多模態(tài)角度理解大腦神經(jīng)回路及信息處理機(jī)制的組織原理提供了底層技術(shù)支撐。

解密大腦中神經(jīng)元之間的連結(jié)模式對(duì)于理解大腦功能至關(guān)重要。利用成像技術(shù)進(jìn)行的神經(jīng)解剖學(xué)追蹤能夠識(shí)別從區(qū)域到區(qū)域或者是單個(gè)神經(jīng)元之間的連接模式（如fMOST），然而這種方法的通量受限，且需要大量的神經(jīng)元形態(tài)重構(gòu)的工作。而基于條形碼的連接組學(xué)則能夠高通量繪制出大量單個(gè)神經(jīng)元的投射組（如MAPseq、BRICseq和BARseq）。然而，除了復(fù)雜的神經(jīng)元投射模式外，大腦中神經(jīng)元的類型和分子表達(dá)譜也高度多樣化，如何獲取并整合分析單個(gè)神經(jīng)元的投射模式與分子特征，依然面臨挑戰(zhàn)。

內(nèi)側(cè)前額葉皮層（mPFC）是一個(gè)復(fù)雜的大腦區(qū)域，參與高階認(rèn)知功能、信息處理（例如記憶和情緒）以及驅(qū)動(dòng)目標(biāo)導(dǎo)向的行動(dòng)。盡管之前的研究已廣泛探究了mPFC的投射模式和功能多樣性，但mPFC神經(jīng)元的投射模式和分子特征之間的關(guān)系仍然不明確。尚未完全明確的科學(xué)問題包括：投射到相同下游腦區(qū)的mPFC神經(jīng)元在它們的轉(zhuǎn)錄組上是否存在差異？其是相同還是不同類型/亞型的神經(jīng)元？具有分支投射的mPFC神經(jīng)元的下游投射位點(diǎn)選擇的規(guī)律是什么？這些“廣播”神經(jīng)元(broadcasting neurons)的細(xì)胞類型和分子特征是什么？

基于上述科學(xué)問題和技術(shù)挑戰(zhàn)，研究人員設(shè)計(jì)了一種多重神經(jīng)元逆向追蹤的方法，能夠同時(shí)對(duì)單個(gè)神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄組和投射組進(jìn)行記錄，稱之為MERGE-seq（Multiplexed projEction neuRons retroGrade barcodE）。研究人員向vmPFC的五個(gè)已知下游目標(biāo)區(qū)域注射了帶有不同條碼的逆行AAV 病毒（rAAV2-retro），包括非顆粒島皮質(zhì)（agranular insular cortex, AI）、背內(nèi)側(cè)紋狀體（dorsomedial striatum, DMS）、基底杏仁核（basolateral amygdala, BLA）、丘腦背內(nèi)側(cè)核（mediodorsal thalamic nucleus, MD）和外側(cè)下丘腦（lateral hypothalamus, LH），使得每個(gè)目標(biāo)區(qū)域都被注射帶有唯一分子條形碼的逆行AAV 病毒。病毒于vmPFC投射在下游腦區(qū)的突觸末梢吸收，并逆行至上游的vmPFC神經(jīng)元胞體并轉(zhuǎn)錄。單個(gè)神經(jīng)元胞體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分子條形碼代表對(duì)應(yīng)的下游腦區(qū)，并在后續(xù)構(gòu)建的投射組文庫中被捕獲。與此同時(shí)，單個(gè)神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄組也可以通過常規(guī)的3'端或全長(zhǎng)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)捕獲（本研究中使用3’端10x Genomics測(cè)序技術(shù)為例）。

研究發(fā)現(xiàn)，投射到相同下游腦區(qū)的vmPFC神經(jīng)元在轉(zhuǎn)錄組上是異質(zhì)的，由轉(zhuǎn)錄組上不同的神經(jīng)元亞型組成。根據(jù)選定的五個(gè)下游腦區(qū)的MERGE-seq數(shù)據(jù)，研究人員發(fā)現(xiàn)vmPFC神經(jīng)元既有專一的投射模式（單神經(jīng)元僅投射一個(gè)下游腦區(qū)），也有分支投射模式（單神經(jīng)元投射到多個(gè)下游腦區(qū)）。研究人員進(jìn)一步揭示了這些專一和分支投射的vmPFC神經(jīng)元的細(xì)胞類型組成和皮層分布，并揭示了它們的分子特征。通過與近期腦智中心嚴(yán)軍研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表的基于fMOST的單神經(jīng)元投射組數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析，研究人員進(jìn)一步驗(yàn)證了MERGE-seq推斷的vmPFC腦區(qū)單神經(jīng)元的投射模式。此外，使用RNA熒光原位雜交（FISH）和雙色逆行AAV標(biāo)記技術(shù)，研究人員驗(yàn)證了皮層第五層Pou3f1陽性的vmPFC神經(jīng)元對(duì)DMS和LH的分支投射。最后，得益于MERGE-seq單細(xì)胞多模態(tài)的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，即兩種模態(tài)的數(shù)據(jù)（投射組與轉(zhuǎn)錄組）共享一個(gè)坐標(biāo)系統(tǒng)（同一個(gè)細(xì)胞），研究人員使用基于機(jī)器學(xué)習(xí)的模型構(gòu)建與模型解釋方法，發(fā)現(xiàn)了可用于預(yù)測(cè)特定投射模式的特定基因簇，為整合現(xiàn)有的單細(xì)胞多模態(tài)的大規(guī)模腦圖譜數(shù)據(jù)提供范例。

A. MERGE-seq實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析示意圖。B.沖擊圖(alluvial plot)顯示了10種最頻繁的vmPFC投射模式在不同vmPFC神經(jīng)元亞型的分布。C. 10種vmPFC投射模式定義的細(xì)胞群的差異表達(dá)基因熱圖。

值得一提的是，該工作是陳躍軍研究組應(yīng)用分子條形碼結(jié)合高通量單細(xì)胞測(cè)序的第三項(xiàng)工作。之前的工作包括對(duì)干細(xì)胞神經(jīng)分化過程中的單細(xì)胞譜系追蹤（2023 Cell Stem Cell, cover story）以及小鼠組織器官發(fā)育的單細(xì)胞譜系追蹤（2023 Nature Methods）。本研究進(jìn)一步擴(kuò)展分子條形碼技術(shù)，成功將其應(yīng)用于多模態(tài)解析大腦復(fù)雜的神經(jīng)連接組。

腦智卓越中心陳躍軍研究員、上?？萍即髮W(xué)羅振革研究員、臨港實(shí)驗(yàn)室李澄宇研究員與腦智卓越中心博士研究生許培博為本論文的共同通訊作者。陳躍軍組博士研究生許培博、羅振革組博士研究生彭建、陳躍軍組袁停利、李澄宇組高級(jí)工程師陳兆琴、陳躍軍組博士研究生何慧為該論文共同第一作者，陳躍軍組吳子彥博士和羅振革組博士研究生李婷對(duì)實(shí)驗(yàn)做出重要貢獻(xiàn)。博士研究生李効東、王露悅博士和臨港實(shí)驗(yàn)室魏武研究員對(duì)生物信息學(xué)分析提供了重要支持。腦智卓越中心嚴(yán)軍研究員和高樂博士對(duì)vmPFC單神經(jīng)元fMOST數(shù)據(jù)的提取提供重要支持。 此外腦智卓越中心光學(xué)平臺(tái)與分子細(xì)胞平臺(tái)提供了重要技術(shù)支持。該研究得到科技部、中國(guó)科學(xué)院、上海市、基金委項(xiàng)目的支持。