2024年3月15日,《eLife》雜志在線發(fā)表了題為《Deciphering the genetic interactions between Pou4f3,Gfi1,and Rbm24 in maintaining cochlear hair cell survival》的研究論文。該研究由中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心（神經科學研究所）劉志勇研究組完成。研究團隊通過一系列基因敲除、敲入以及轉基因小鼠模型，揭示了毛細胞維持存活過程中三個重要調控基因Pou4f3、Gfi1以及Rbm24之間的相互作用關系，確定了Pou4f3而非Gfi1正向調控Rbm24基因的表達，并鑒定出3個之前未知的Rbm24的增強子。同時，該研究也證明這3個增強子是在耳蝸毛細胞有活性，可以用于制備毛細胞特異的AAV,用于耳聾基因治療。該研究通過扎實的體內遺傳學實驗數據，首次闡明了毛細胞存活必需的新基因Rbm24與其它兩個關鍵基因Pou4f3與Gfi1的相互作用關系，為毛細胞存活的分子機制提供了新的見解，并為耳聾治療提供了新的思路與方法。

根據WHO公布的數據，目前有超過5%的世界人口，即4.3億人（4.32億成年人和3400萬兒童）正遭受聽力喪失的影響，預估到2050年，患有聽力障礙的人數將達到7億人。哺乳動物耳蝸內僅存數量有限的毛細胞，它們是聽覺系統(tǒng)中的重要組成部分。毛細胞能夠將聲波轉化為神經信號，最終傳遞給大腦，從而感知聲音。然而，有很多耳毒性因素如基因突變、噪音、藥物、衰老等會導致毛細胞死亡。毛細胞損傷是導致感音性耳聾的主要原因，一旦毛細胞受損，它們便無法再生，從而致使聽力發(fā)生不可逆轉的損傷。因此，探索維持毛細胞存活的分子機制對于預防聽力喪失、以及耳聾治療至關重要。

Pou4f3、Gfi1以及Rbm24都是維持毛細胞存活所必需的基因。有趣的是，Pou4f3或Gfi1基因缺失的毛細胞雖然最初可以形成，但隨后會迅速死亡。相比之下，Rbm24基因缺失的毛細胞死亡時間明顯滯后。此外，這3個基因在耳蝸中的時空表達模式非常相似。然而，關于Pou4f3、Gfi1和Rbm24之間的轉錄級聯(lián)調控機制目前知之甚少。該研究通過構建一系列基因敲除小鼠模型，結合免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)Rbm24在Pou4f3-/-毛細胞中的表達被完全抑制（圖1 A-B’’’），但在Gfi1-/-毛細胞中的表達不受影響（圖1 C-D’’）。此外，Pou4f3和Gfi1在Rbm24-/-毛細胞中的表達也不受影響（圖1 E-F’’）。這些研究結果表明：Pou4f3是Rbm24的上游調控必須基因，而Gfi1與Rbm24互不依賴。

圖1. Pou4f3而非Gfi1是Rbm24的上游調控基因。A-B’’’. Rbm24在Pou4f3-/-毛細胞中的表達完全受到抑制，Bcl11b是外毛細胞的標記基因；A-A’’’. Pou4f3野生型小鼠中Rbm24正常表達；B-B’’’. Pou4f3敲除小鼠中，毛細胞正常，但Rbm24表達完全消失。C-D’’. Rbm24在Gfi1-/-毛細胞中表達不受影響，HA是融合在Gfi1末端的標簽蛋白，用于表征Gfi1蛋白表達情況；與Gfi1野生型毛細胞類似（C-C’’），Gfi1敲除的毛細胞中Rbm24的表達未發(fā)生改變（D-D’’）。E-F’’. Pou4f3與Gfi1的表達不受Rbm24缺失的影響。

進?一步，通過分析小鼠耳蝸毛細胞ATAC-seq與Pou4f3的Cut&Run數據，發(fā)現(xiàn)Rbm24基因組上存在3個能被Pou4f3結合的順式DNA調控序列。研究人員通過構建轉基因小鼠模型，確定了這3個順式DNA調控序列是Rbm24的增強子，其誘導的綠色熒光報告基因只在毛細胞內表達。最后，研究人員試圖通過回補Rbm24，來緩解或阻止Pou4f3缺失導致的毛細胞退化死亡，結果發(fā)現(xiàn)：僅靠外源性的Rbm24并不能緩解Pou4f3缺失小鼠中毛細胞的丟失。這個結果提示：Pou4f3-Rbm24的級聯(lián)調控通路只是Pou4f3的下游調控通路之一，其他維持毛細胞存活的Pou4f3下游基因有待后續(xù)研究。

圖2. Pou4f3通過結合Rbm24的3個增強子來調控Rbm24的表達。A. Pou4f3能夠與Rbm24基因3個遠端的順式調控位點結合，A圖上半部分與下半部分分別是IGV軟件可視化毛細胞ATAC-seq（染色體可及性），以及Pou4f3的Cut&Run（轉錄因子結合DNA）的結果。B-G’. Rbm24三個遠端的調控元件(Eh1,Eh2和Eh3) 均能單獨驅動EGFP在耳蝸毛細胞中特異性表達；IHC是內毛細胞；OHC是外毛細胞；Myo7a是毛細胞的標記基因。

總之，該研究為毛細胞存活的分子和遺傳機制提供了新的見解，其中新發(fā)現(xiàn)的3個Rbm24的增強子對于耳聾基因治療有很高的潛在臨床應用價值，可用于開發(fā)耳蝸毛細胞靶向基因治療的新型AAV工具。

中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心劉志勇研究員為本論文的通訊作者，劉志勇組博士研究生王廣琴為本論文的第一作者，博士研究生顧云鵬也為本項目作出了貢獻。中國科學院腦智卓越中心光學平臺和嚙齒類實驗動物平臺提供了重要技術支持。該研究獲得了國家自然科學基金委員會、科技部、上海市科委和中國科學院的資助。