6月10日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Communications Biology在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）叢堯研究組題為 “An immobilized antibody-based affinity grid strategy for on-grid purification of target proteins enables high-resolution cryo-EM”的研究論文。該研究應(yīng)用Pyr-NHS作為接頭（linker），結(jié)合高親和力的PA標(biāo)簽/NZ-1抗體系統(tǒng)，發(fā)展了錨定抗體的親和載網(wǎng)（IAAG）策略，成功實(shí)現(xiàn)了直接從細(xì)胞裂解液中親和純化低豐度的目標(biāo)蛋白進(jìn)行冷凍制樣。這一方法極大地簡(jiǎn)化了樣品純化過程，并實(shí)現(xiàn)了原子分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析，顯示該方法在冷凍電鏡結(jié)構(gòu)研究中具有廣泛的應(yīng)用潛力。

近年來，隨著分辨率革命的到來，冷凍電鏡（cryo-EM）技術(shù)已成為生物大分子結(jié)構(gòu)研究的強(qiáng)有力工具。然而，很多生物大分子復(fù)合體豐度低、不穩(wěn)定，且易受與氣-液界面（AWI）相關(guān)的取向傾向性或聚集等問題的影響。因此，冷凍樣品制備尤其是針對(duì)上述復(fù)合體的制備已成為cryo-EM的主要技術(shù)瓶頸。親和載網(wǎng)方法，甚至應(yīng)用親和載網(wǎng)進(jìn)行在網(wǎng)（on-grid）的目標(biāo)蛋白純化，是解決上述問題的一種極具潛力的方案。然而，現(xiàn)有的親和載網(wǎng)制備方法及應(yīng)用過程復(fù)雜繁瑣，需要特殊的處理或工具，以及豐富的用戶經(jīng)驗(yàn)。此外，初始的應(yīng)用親和載網(wǎng)進(jìn)行 on-grid 純化樣品的嘗試，其應(yīng)用范圍和解析目標(biāo)樣品的分辨率有限（大多數(shù)分辨率限制在 8-40 ?）。因此，迫切需要開發(fā)一種更有效且用戶友好的親和載網(wǎng)方法，用于on-grid樣品純化，克服AWI引起的相關(guān)問題，同時(shí)有助于實(shí)現(xiàn)高分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析。

為了解決上述問題，該研究發(fā)展了一種基于高親和力PA標(biāo)簽/NZ-1抗體系統(tǒng)的錨定抗體的親和載網(wǎng)（IAAG）策略。研究人員使用了小分子交聯(lián)劑Pyr-NHS，其一端可通過π-π相互作用非共價(jià)錨定到具有sp²雜化碳晶格的碳/石墨烯/氧化石墨烯（GO）覆蓋的載網(wǎng)表面；另一端具有生物活性酯基團(tuán)，可與NZ-1的Fab片段或其他抗體及蛋白質(zhì)中的伯胺發(fā)生反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵，將目標(biāo)分子固定于載網(wǎng)表面，從而完成IAAG親和載網(wǎng)的組裝。采用IAAG親和載網(wǎng)策略，不僅能夠?qū)?span lang="en-US">PA 標(biāo)記的目標(biāo)蛋白進(jìn)行富集，實(shí)現(xiàn)了原子分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析；而且如冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）分析顯示樣品均分布于承載膜附近，從而克服了氣-液界面引起的取向傾向性問題。值得注意的是，應(yīng)用IAAG策略，研究人員成功實(shí)現(xiàn)了從細(xì)胞裂解液中直接on-grid純化低豐度的目標(biāo)復(fù)合體進(jìn)行冷凍制樣，并獲得了高分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。

IAAG 策略具有用戶友好且高效的特點(diǎn)。該策略采用市售的GO/石墨烯/碳膜覆蓋的載網(wǎng)和交聯(lián)劑Pyr-NHS，IAAG載網(wǎng)組裝時(shí)間不超過2小時(shí)，并且該策略無需通過計(jì)算去除背景噪音。上述因素使得該方法更具用戶友好性和高效性，即使在非專業(yè)實(shí)驗(yàn)室中也能夠使用。此外，IAAG方法具有良好的拓展性，通過使用Pyr-NHS作為linker，還可以將其他抗體、Fab、納米抗體或誘餌蛋白非共價(jià)錨定到上述載網(wǎng)表面，用于親和純化和冷凍制樣。

綜上，采用IAAG親和載網(wǎng)策略成功實(shí)現(xiàn)了低豐度蛋白樣品直接從細(xì)胞裂解液中on-grid純化和高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析，極大簡(jiǎn)化了繁瑣的蛋白質(zhì)純化過程，減少了對(duì)大量生物樣品的需求，并有助于解決冷凍制樣中氣-液界面相關(guān)的常見挑戰(zhàn)。IAAG策略高效、易操作，用戶友好，且具有很好的拓展性。該方法在冷凍電鏡和冷凍電子斷層掃描結(jié)構(gòu)研究中具有廣泛的應(yīng)用潛力和拓展性。

分子細(xì)胞卓越中心博士研究生趙巧鈺和已畢業(yè)的碩士研究生洪曉喻為該論文的共同第一作者，叢堯研究員為通訊作者。該研究獲得中國(guó)科學(xué)院、國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)、國(guó)家科技部和上海市科委等項(xiàng)目的資助；同時(shí)得到國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（上海）設(shè)施的冷凍電鏡系統(tǒng)、數(shù)據(jù)庫(kù)與計(jì)算分析系統(tǒng)和蛋白質(zhì)表達(dá)純化系統(tǒng)，分子細(xì)胞卓越中心細(xì)胞分析技術(shù)平臺(tái)和賽默飛上海納米港的大力支持。

文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s42003-024-06406-z#Sec23

IAAG親和載網(wǎng)的制備及其在冷凍電鏡高分辨率結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用。（a）IAAG親和載網(wǎng)的制備及其應(yīng)用于從細(xì)胞裂解液中特異性親和純化目標(biāo)蛋白的示意圖。（b）應(yīng)用IAAG親和載網(wǎng)克服酵母源CCT6同源寡聚環(huán)（CCT6-HR）復(fù)合體的樣品分布取向傾向性問題。（c）應(yīng)用IAAG親和載網(wǎng)從細(xì)胞裂解液中直接on-grid親和純化表達(dá)量極低的CCT6-HR復(fù)合體，并用于高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析。