7月4日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Nature Methods在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）陳玲玲研究組關(guān)于CRISPR-dCas12a應(yīng)用于DNA活細(xì)胞標(biāo)記的最新研究進(jìn)展：“CRISPR array-mediated imaging of non-repetitive and multiplex genomic loci in living cells”。該研究對(duì)現(xiàn)有的CRISPR-dCas12a系統(tǒng)進(jìn)行了篩選優(yōu)化，構(gòu)建了可用于非重復(fù)序列DNA活細(xì)胞成像的CRISPRdelight系統(tǒng)；進(jìn)一步利用CRISPRdelight系統(tǒng)揭示了基因位點(diǎn)在細(xì)胞核內(nèi)的定位與其運(yùn)動(dòng)能力和轉(zhuǎn)錄活性的相關(guān)性；同時(shí)利用RNA適配體修飾的CRISPR串聯(lián)序列實(shí)現(xiàn)了對(duì)4種衛(wèi)星DNA的活細(xì)胞多色成像。

活細(xì)胞追蹤DNA、RNA等核酸的空間分布和動(dòng)態(tài)變化對(duì)于了解基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有十分重要的意義。CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種來(lái)源于細(xì)菌和古細(xì)菌體內(nèi)的獲得性免疫系統(tǒng)，由于其特異性靶向DNA/RNA的能力，已被廣泛開發(fā)成多種細(xì)胞內(nèi)DNA/RNA的遺傳操作和檢測(cè)標(biāo)記的工具。陳玲玲研究組前期構(gòu)建了基于CRISPR-dCas13的RNA標(biāo)記系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞和斑馬魚胚胎內(nèi)RNA的成像追蹤，以及活細(xì)胞RNA多色成像(Yang et al., Mol Cell, 2019; Huang et al., Genome Bio, 2023; Yang et al., Cell Insight, 2022)。此外，經(jīng)過(guò)改造的靶向DNA的CRISPR-Cas9系統(tǒng)可用于活細(xì)胞DNA成像標(biāo)記(Chen et al., Cell, 2013; Ma et al., Nat Biotechnol, 2016)。這些CRISPR系統(tǒng)在標(biāo)記內(nèi)源核酸序列方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，然而對(duì)于非重復(fù)DNA/RNA序列的活細(xì)胞特異性成像目前仍存在著諸多限制。

CRISPR-Cas12a系統(tǒng)屬于類型V的CRISPR-Cas家族，在靶向DNA的同時(shí)還具備將CRISPR串聯(lián)序列加工成多條成熟crRNA的能力（Zetsche, B. et al., Cell, 2015）。因此，CRISPR-Cas12a系統(tǒng)理論上可以通過(guò)CRISPR串聯(lián)序列在同一細(xì)胞內(nèi)表達(dá)足夠數(shù)量的crRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)非重復(fù)序列DNA的標(biāo)記。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究人員選取了三種已報(bào)道的能顯著提高基因編輯效率的dLbCas12a突變體，并對(duì)它們?cè)跇?biāo)記微衛(wèi)星DNA Sat I和Sat III方面的能力進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，hyperdLbCas12a突變體（D156R，D235R，D292R，D350R）可以實(shí)現(xiàn)更高的標(biāo)記效率和信號(hào)質(zhì)量。研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)hyperdLbCas12a可以加工CRISPR串聯(lián)序列，并維持與直接表達(dá)成熟crRNA近似的DNA標(biāo)記能力，同時(shí)篩選出了能夠表達(dá)長(zhǎng)達(dá)50次crRNA重復(fù)序列的CAG啟動(dòng)子，并基于此構(gòu)建了用于活細(xì)胞DNA成像的CRISPRdelight系統(tǒng)。

研究人員針對(duì)CCAT1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游10kb的區(qū)域設(shè)計(jì)了48條gRNA，使用CRISPRdelight系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了CCAT1基因位點(diǎn)的活細(xì)胞標(biāo)記。以同樣的方式，CRISPRdelight系統(tǒng)在其他6個(gè)非重復(fù)序列基因位點(diǎn)均得到了有效驗(yàn)證，并且該系統(tǒng)在HCT116、U2OS以及小鼠胚胎干細(xì)胞（R1）中同樣有效。CRISPRdelight系統(tǒng)相較于之前報(bào)道的基于CRISPR-dCas9的CARGO活細(xì)胞標(biāo)記系統(tǒng)（Gu, B. et al.，Science, 2018），具有質(zhì)粒構(gòu)建成本低、周期短、可表達(dá)gRNA數(shù)量多、標(biāo)記系統(tǒng)組成更簡(jiǎn)潔等多方面優(yōu)點(diǎn)。

研究人員利用CRISPRdelight系統(tǒng)進(jìn)一步分析了CCAT1在細(xì)胞核內(nèi)的分布特點(diǎn)和運(yùn)動(dòng)特征。研究結(jié)果顯示，位于細(xì)胞核膜處Lamin蛋白層的CCAT1位點(diǎn)運(yùn)動(dòng)能力明顯弱于位于細(xì)胞核內(nèi)的CCAT1位點(diǎn)；進(jìn)一步檢測(cè)CCAT1的內(nèi)含子表達(dá)信號(hào)，發(fā)現(xiàn)Lamin蛋白層的CCAT1位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄活性也更弱。同時(shí)，研究人員對(duì)HSPH1、HSPA1A等熱休克基因進(jìn)行了標(biāo)記，在向細(xì)胞施加42°C或亞砷酸鈉刺激后，發(fā)現(xiàn)定位于核斑的HSPH1基因位點(diǎn)會(huì)明顯增多，并且位于核斑的基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄活性也明顯更強(qiáng)。這些結(jié)果表明了基因組DNA的細(xì)胞核內(nèi)空間位置與其運(yùn)動(dòng)能力和表達(dá)活性的相關(guān)性。

最后，研究人員通過(guò)RNA結(jié)構(gòu)優(yōu)化，成功將BoxB、Pepper、PP7和MS2 等RNA適配子元件插入至gRNA中，利用CRISPRdelight系統(tǒng)和這些元件對(duì)應(yīng)的融合熒光蛋白，實(shí)現(xiàn)了微衛(wèi)星DNA Sat I、Sat II、Sat III和Sat α的活細(xì)胞四色標(biāo)記。CRISPRdelight系統(tǒng)為研究活細(xì)胞中DNA位點(diǎn)的空間位置和動(dòng)力學(xué)特征，提供了更簡(jiǎn)單和便利的新手段。

分子細(xì)胞卓越中心楊良中博士（已畢業(yè)）、敏逸暉碩士和劉昱昕博士為該論文的共同第一作者，陳玲玲研究員為通訊作者。該項(xiàng)工作得到霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所Zhe (James) Liu教授、復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院/復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院楊力研究員、清華大學(xué)王海峰博士的大力支持。該研究獲得分子細(xì)胞卓越中心細(xì)胞分析技術(shù)平臺(tái)的技術(shù)支持，并獲國(guó)家自然科學(xué)基金、科技部、中國(guó)科學(xué)院及上海市科委的基金支持。

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CRISPRdelight系統(tǒng)能夠有效標(biāo)記多個(gè)基因組非重復(fù)DNA位點(diǎn)。向gRNA中插入不同的RNA適配子后，CRISPRdelight系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因組位點(diǎn)的活細(xì)胞多色成像。