2024年10月8日，《Nature Methods》期刊在線發(fā)表了題為《Volumetric Voltage Imaging of Neuronal Populations in Mouse Brain by Confocal Light Field Microscope》的研究論文。該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）王凱研究組完成。研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種新型三維光場顯微成像技術(shù)，顯著提升了神經(jīng)元電壓光學(xué)成像的通量。這項(xiàng)技術(shù)能夠?qū)π∈竽X三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中數(shù)百神經(jīng)元的膜電位進(jìn)行高速同步記錄，為深入解析神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的信息處理機(jī)制提供了新的有力工具。

對(duì)大腦工作原理的解析離不開對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行功能活動(dòng)的記錄。神經(jīng)元通過細(xì)胞膜電位的變化來編碼和傳遞信息，傳統(tǒng)電生理技術(shù)主要通過在大腦中插入不同形態(tài)和功能的電極來檢測神經(jīng)元微弱的電信號(hào)，這些技術(shù)的發(fā)展在歷史上極大推動(dòng)了神經(jīng)科學(xué)的進(jìn)步。近年來，結(jié)合功能熒光探針和光學(xué)成像的神經(jīng)元功能光學(xué)成像技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)研究中引發(fā)了一場技術(shù)革命。與傳統(tǒng)電生理技術(shù)相比，光學(xué)功能成像技術(shù)具有通量高、非侵入和分子特異性高等優(yōu)點(diǎn)。然而，由于直接對(duì)神經(jīng)元膜電位進(jìn)行功能光學(xué)成像面臨諸多技術(shù)挑戰(zhàn)，目前研究人員普遍選擇通過光學(xué)檢測神經(jīng)元的胞內(nèi)鈣離子濃度來間接獲得神經(jīng)元的激活狀態(tài)。然而，這項(xiàng)技術(shù)缺乏解析單個(gè)動(dòng)作電位的時(shí)間分辨率，也無法準(zhǔn)確記錄神經(jīng)元閾下膜電位的變化，在深入解析神經(jīng)信號(hào)處理機(jī)制等方面存在不足。因此，開發(fā)能夠?qū)ι窠?jīng)元膜電位進(jìn)行大規(guī)模光學(xué)記錄的新技術(shù)一直是神經(jīng)科學(xué)研究的長期愿景和技術(shù)前沿。

相比于鈣離子成像，電壓成像的速度提升近100倍。不僅要求圖像采集速率提高100倍，還對(duì)在有限的熒光信號(hào)中高效捕捉微弱的電壓信號(hào)提出了極高的要求，給電壓敏感熒光探針和光學(xué)成像技術(shù)帶來了巨大的挑戰(zhàn)。目前，最高通量的電壓光學(xué)記錄主要通過寬場熒光顯微鏡對(duì)小鼠腦淺表神經(jīng)元進(jìn)行成像來實(shí)現(xiàn)，但其穿透深度小、效率低、通量有限等缺點(diǎn)限制了其在神經(jīng)科學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用。

為了提高電壓成像的通量，并實(shí)現(xiàn)對(duì)三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的同步成像，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了基于三維光場成像技術(shù)的電壓成像新方法。三維光場顯微鏡是一種高度并行化的成像技術(shù)，能夠在一次相機(jī)曝光中對(duì)三維體進(jìn)行同時(shí)成像。王凱研究組長期致力于光場成像新技術(shù)的開發(fā)，并將其應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究：研究團(tuán)隊(duì)曾發(fā)明拓展視場光場顯微鏡，首次實(shí)現(xiàn)自由行為斑馬魚的全腦神經(jīng)元鈣離子功能成像（Cong et al., eLife 2017）；并進(jìn)一步創(chuàng)新提出廣義共聚焦原理，發(fā)明共聚焦光場顯微成像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)小鼠腦神經(jīng)元和三維血管網(wǎng)絡(luò)循環(huán)血細(xì)胞的快速成像（Zhang et al., Nature Biotechnology 2021）。雖然光場成像的高速成像能力對(duì)電壓成像具有天然優(yōu)勢，但仍面臨光效率低，速度與視場的矛盾，以及連續(xù)成像能力不足等問題。為此，研究團(tuán)隊(duì)逐一攻克這些技術(shù)難題，首次實(shí)現(xiàn)大范圍神經(jīng)元群體的三維電壓成像。

首先，光場成像需要一個(gè)高靈敏度、大靶面的相機(jī)來同時(shí)記錄多個(gè)視角的投影圖像。然而，由于相機(jī)的數(shù)據(jù)帶寬受限，大靶面相機(jī)的幀率無法滿足電壓成像的速度需求。為此，研究團(tuán)隊(duì)提出通過降低采集圖像的動(dòng)態(tài)范圍來換取更高的幀率。通常，電壓成像需要較高的動(dòng)態(tài)范圍來捕捉高基線上微弱變化的信號(hào)。但研究團(tuán)隊(duì)采用廣義共聚焦原理（Zhang et al., Nature Biotechnology 2021），高選擇性濾除背景來降低信號(hào)基線，并有效整合多個(gè)視角的信息，實(shí)現(xiàn)了利用低動(dòng)態(tài)范圍的相機(jī)來高效捕捉微弱的電壓信號(hào)。

進(jìn)一步地，由于電壓成像信號(hào)微弱，極易淹沒在噪聲中。為了最大限度降低系統(tǒng)的噪聲，研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)性地研究了光場成像中的噪聲來源，發(fā)現(xiàn)激光光源的強(qiáng)度噪聲，掃描振鏡的同步噪聲以及動(dòng)物血液流動(dòng)導(dǎo)致的激光散斑噪聲都顯著降低了電壓成像的信噪比。為了克服這些難題，研究人員創(chuàng)新地提出基于單振鏡雙面掃描的共聚焦光場成像技術(shù)，結(jié)合高數(shù)值孔徑的光照明策略和新數(shù)據(jù)處理方法，有效將系統(tǒng)噪聲降低至泊松噪聲理論極限。

最后，為了最大化熒光信號(hào)的捕獲效率，實(shí)現(xiàn)長時(shí)程持續(xù)電壓成像，研究團(tuán)隊(duì)優(yōu)化了系統(tǒng)的光學(xué)效率。通過自主設(shè)計(jì)定制密集排列的微透鏡陣列，并最小化光學(xué)元件的數(shù)量，系統(tǒng)的通光效率比前期工作提高約3倍。

研究團(tuán)隊(duì)將這些關(guān)鍵創(chuàng)新有機(jī)整合在新型共聚焦光場顯微鏡中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)清醒小鼠腦三維視場中（直徑800微米，厚度180微米）數(shù)百個(gè)神經(jīng)元的電壓信號(hào)開展同步記錄，并以每秒400幀的速度連續(xù)成像超過20分鐘。至此，新型共聚焦光場顯微鏡彌補(bǔ)了電壓成像在成像通量、信噪比與成像時(shí)長上的不足，極大地提升了電壓成像的應(yīng)用范圍。為了驗(yàn)證電壓成像獲取的信號(hào)真實(shí)可靠，研究團(tuán)隊(duì)記錄了清醒小鼠初級(jí)視皮層中數(shù)百個(gè)神經(jīng)元對(duì)光柵視覺刺激的反應(yīng)特性。通過對(duì)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放情況的統(tǒng)計(jì)，電壓成像成功鑒別出具有不同方向選擇性的神經(jīng)元，且這些具有調(diào)諧特征的神經(jīng)元占比與該區(qū)域已知的神經(jīng)元特性相符。進(jìn)一步，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)數(shù)百個(gè)神經(jīng)元構(gòu)成的三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了功能連接分析。由于電壓成像能夠提供神經(jīng)元的閾下膜電位信息，這一分析在傳統(tǒng)鈣離子成像和胞外電生理記錄實(shí)驗(yàn)中無法實(shí)現(xiàn)。與膜片鉗記錄相比，電壓成像可在清醒動(dòng)物中開展，且通量提高約100倍。分析表明，神經(jīng)元之間同時(shí)存在興奮性和抑制性功能連接，并且在短距離內(nèi)，抑制性連接強(qiáng)于興奮性連接。這種興奮-抑制的連接差異在三維空間上近似垂直于皮層表面的圓柱體。

總結(jié)而言，該研究開發(fā)了一種新型三維電壓成像新技術(shù)，大幅度提高了電壓成像的通量，使在清醒動(dòng)物中進(jìn)行三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的功能聯(lián)接分析成為可能。這一關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)步為電壓成像技術(shù)的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，為神經(jīng)科學(xué)研究提供了新的有力工具。

中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）的博士后白璐和副研究員叢林為該研究的共同第一作者，穆宇研究員，徐寧龍研究員和熊志奇研究員參與指導(dǎo)了該項(xiàng)工作，王凱研究員為本論文的通訊作者。這項(xiàng)研究得到了科技部、國家自然科學(xué)基金委、中國科學(xué)院青促會(huì)、上海市及中國博士后科學(xué)基金的經(jīng)費(fèi)資助。

圖1 三維光場電壓成像顯微鏡示意圖和小鼠腦三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電壓成像示例圖