3月1日，《科學(xué)》發(fā)表了一篇名為《胞嘧啶單堿基編輯會(huì)導(dǎo)致大量單核苷酸突變的脫靶》的研究論文，該研究由中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所（中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心）、上海腦科學(xué)與類腦研究中心、神經(jīng)科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國科學(xué)院靈長類神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊輝研究組與中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所隸屬的計(jì)算生物學(xué)研究所（中國科學(xué)院-馬普學(xué)會(huì)計(jì)算生物學(xué)伙伴研究所）、斯坦福大學(xué)遺傳學(xué)系以及中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所合作完成。該研究建立了一種被命名為GOTI（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection）的新型脫靶檢測技術(shù)，并使用該技術(shù)發(fā)現(xiàn): 近年來興起的單堿基編輯技術(shù)有可能導(dǎo)致大量無法預(yù)測的脫靶，因而存在嚴(yán)重的安全風(fēng)險(xiǎn)。此研究顯著提高了基因編輯技術(shù)脫靶檢測的敏感性，并且可以在不借助于任何脫靶位點(diǎn)預(yù)測技術(shù)的情況下發(fā)現(xiàn)之前的脫靶檢測手段無法發(fā)現(xiàn)的完全隨機(jī)的脫靶位點(diǎn)，為基因編輯工具的安全性評估帶來了突破性的新工具，有望成為新的行業(yè)檢測標(biāo)準(zhǔn)。

CRISPR/Cas9是廣泛關(guān)注的新一代基因編輯工具，自從2012年被發(fā)明以來，它一直以其高效性和特異性備受世人的期待，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為基于CRISPR/Cas9及其衍生工具的臨床技術(shù)將為人類的健康做出巨大貢獻(xiàn)。然而值得注意的是，CRISPR/Cas9從問世以來，其脫靶風(fēng)險(xiǎn)一直備受關(guān)注，如果將CRISPR/Cas9及其衍生工具用于臨床的話，脫靶效應(yīng)可能會(huì)引起包括癌癥在內(nèi)的很多種副作用。在此之前，人們推出過多種檢測脫靶的方案。以前的方法或者依賴于計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測，或者依賴于高通量測序檢測DSB產(chǎn)生，還有體外檢測的方法。這些方法都存在一些局限性，不能高靈敏性檢測到脫靶突變，尤其是單核苷酸突變。因此關(guān)于CRISPR/Cas9及其衍生工具的真實(shí)脫靶率一直存在爭議。因此一種能夠突破之前限制的脫靶檢測技術(shù)，將會(huì)成為CRISPR/Cas9及其衍生工具是否能最終走上臨床的關(guān)鍵。人們迫切希望可以找到一種既能夠不依賴于脫靶位點(diǎn)預(yù)測，又能有足夠信噪比的精密脫靶檢測手段。

因此，如果要提升檢測脫靶效應(yīng)的精度，就必須徹底顛覆原有的脫靶檢測手段。首先，為了實(shí)現(xiàn)不借助于脫靶位點(diǎn)預(yù)測，這就要求必須找到非常嚴(yán)格的對照組來確定基因突變的位點(diǎn)；同時(shí)為了檢測不依賴于sgRNA的隨機(jī)突變，最好使用基于單細(xì)胞全基因組測序。為了實(shí)現(xiàn)以上目標(biāo)，楊輝研究組與合作者建立了一種名叫“GOTI”的脫靶檢測技術(shù)。研究者們在小鼠受精卵分裂到二細(xì)胞期的時(shí)候，編輯一個(gè)卵裂球，并使用紅色熒光蛋白將其標(biāo)記。小鼠胚胎發(fā)育到14.5天時(shí)，將整個(gè)小鼠胚胎消化成為單細(xì)胞，利用流式細(xì)胞分選技術(shù)基于紅色熒光蛋白，分選出基因編輯細(xì)胞和沒有基因編輯細(xì)胞，再進(jìn)行全基因組測序比較兩組差異。這樣就避免了單細(xì)胞體外擴(kuò)增帶來的噪音問題。而且由于實(shí)驗(yàn)組和對照組來自同一枚受精卵，理論上基因背景完全一致，因此直接比對兩組細(xì)胞的基因組，其中的差異基本就可以認(rèn)為是基因編輯工具造成的。

在楊輝實(shí)驗(yàn)室全體成員與合作單位的共同努力下，GOTI系統(tǒng)被成功建立了起來。借助于這個(gè)系統(tǒng)，團(tuán)隊(duì)成員先是檢測了最經(jīng)典的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，設(shè)計(jì)良好的CRISPR/Cas9并沒有明顯的脫靶效應(yīng)，這個(gè)結(jié)果結(jié)束了之前對于CRISPR/Cas9脫靶率的爭議。然而團(tuán)隊(duì)還檢測了另一個(gè)同樣被給予厚望的CRISPR/Cas9衍生技術(shù)BE3，這個(gè)系統(tǒng)可以精確引入點(diǎn)突變，在之前的研究中從未發(fā)現(xiàn)過有明顯的脫靶問題。然而在GOTI的檢測下發(fā)現(xiàn)，BE3存在非常嚴(yán)重的脫靶，而且這些脫靶大多出現(xiàn)在傳統(tǒng)脫靶預(yù)測認(rèn)為不太可能出現(xiàn)脫靶的位點(diǎn)，因此之前方法一直沒有發(fā)現(xiàn)其脫靶問題。團(tuán)隊(duì)分析后認(rèn)為，這些脫靶位點(diǎn)有部分出現(xiàn)在抑癌基因上，因此經(jīng)典版本的BE3有著很大的隱患，目前不適合作為臨床技術(shù)。研究團(tuán)隊(duì)的這些重要發(fā)現(xiàn)，證實(shí)了以BE3為代表的部分基因編輯技術(shù)存在無法預(yù)測的脫靶風(fēng)險(xiǎn)，讓世人重新審視了這些新興技術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)。更重要的是，此工作建立了一種在精度、廣度和準(zhǔn)確性上遠(yuǎn)超越之前的基因編輯脫靶檢測技術(shù)，有望由此開發(fā)精度更高、安全性更大的新一代基因編輯工具，建立行業(yè)的新標(biāo)準(zhǔn)。

該項(xiàng)工作由中科院神經(jīng)所博士后左二偉（現(xiàn)任中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所研究員），計(jì)算生物學(xué)所博士研究生孫怡迪，計(jì)算生物學(xué)所研究員魏武，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所助理研究員袁堂龍等科研人員，在中科院神經(jīng)所楊輝研究員, 計(jì)算生物學(xué)所李亦學(xué)研究員，斯坦福大學(xué)Lars M. Steinmetz教授的共同指導(dǎo)下完成，課題組的其他成員積極參與，并得到了神經(jīng)所流式分選平臺(tái)、動(dòng)物平臺(tái)、基因編輯平臺(tái)的大力協(xié)助，是眾多課題組通力合作的重要成果。本工作得到國家高科技研發(fā)項(xiàng)目(2018YFC2000100與2017YFC1001302 to Yang Hui, 2017YFC0908405 to WW)，中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(XDB32060000)，國家自然科學(xué)基金委員會(huì)(31871502, 31522037)，上海市科技重大項(xiàng)目(2018SHZDZX05)，上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)項(xiàng)目(18411953700, 18JC1410100)，美國國立衛(wèi)生研究院P01項(xiàng)目(P01HG00020527 to L.M.S.)等項(xiàng)目的資助。